Wat lê ten grondslag van DNA-hibridisasie? Alhoewel die dubbelstring-DNS-volgorde oor die algemeen stabiel is onder fisiologiese toestande, sal die verandering van hierdie toestande in die laboratorium (tipies deur die omgewingstemperatuur te verhoog) veroorsaak dat die molekules in individuele stringe skei. Laasgenoemde is aanvullend tot mekaar, maar kan ook ander reekse wat in hul omgewing voorkom, komplementeer. Die verlaging van die omgewingstemperatuur laat die enkelstrengige molekules toe om uit te gloei of met mekaar te "verbaster". Dit is die DNA-hibridisasiemetode.
Die konsep vanuit die oogpunt van molekulêre biologie
Wetenskaplikes wat betrokke is by beide DNA-replikasie en die transkripsie van DNA na RNA maak staat op nukleotiedkruisings en molekulêre biologie tegnieke. Dit sluit suidelike en noordelike vlekke, polimerase kettingreaksie (PCR) en meeste DNA-RNA hibridisasie en volgordebepaling benaderings in.
Aansoek
Hibridisering is die hoofeienskap van nukleotiedrye en word in talle metodes van molekulêre biologie gebruik. Die algehele genetiese verwantskap van twee spesies kan bepaal word deur segmente van hul DNA te hibridiseer (DNA-DNA hibridisasie). As gevolg van volgorde-ooreenkomste tussen naverwante organismes, is 'n hoër temperatuur nodig om sulke DNS-basters te smelt in vergelyking met meer verafgeleë organismes. Verskeie metodes gebruik hibridisasie om die oorsprong van 'n DNA-monster te bepaal, insluitend die polimerase-kettingreaksie (PCR). In 'n ander metode word kort DNS-volgordes met sellulêre mRNA gehibridiseer om uitgedrukte gene te identifiseer. Farmaseutiese maatskappye ondersoek die gebruik van antisense RNA om aan ongewenste mRNA te bind, wat verhoed dat die ribosoom mRNA in proteïen vertaal.
DNA-DNA-hibridisasie verwys gewoonlik na 'n molekulêre biologie-tegniek wat die mate van genetiese ooreenkoms tussen poele van DNA-volgordes meet. Dit word algemeen gebruik om die genetiese afstand tussen twee organismes te bepaal. Dit is wyd gebruik in filogenie en taksonomie.
Metode
DNS van een organisme is gemerk, dan gemeng met ongemerkte DNA wat daarmee vergelyk kan word. Die mengsel word geïnkubeer om die DNA-stringe te laat dissosieer en dan af te koel om 'n geregenereerde baster-dubbelstring-DNS te vorm. Gehibridiseerde rye met 'n hoë mate van ooreenkoms sal sterker bind en meer energie benodig om hulle te skei: dit wil sê, hulle skei wanneer dit teen 'n hoër verhitting verhit word.temperatuur as ongelyksoortige rye, 'n proses bekend as "DNA-smelting".
DNA wat smelt
Deur die smeltprofiel van die gehibridiseerde DNA te evalueer, word die dubbelstring-DNS aan 'n sogenaamde "kolom" gebind en die resulterende mengsel word verhit. By elke stap word die kolom gewas en die DNS-volgordes wat smelt word enkelstrengig en spoel van die kolom af. Die temperature waarteen gemerkte DNS die kolom verlaat, weerspieël die hoeveelheid ooreenkomste tussen rye (en die selfvoupatroon dien as 'n kontrole). Hierdie resultate word gekombineer om die mate van genetiese ooreenkoms tussen organismes te bepaal. Volgens moderne mikrobiologie is DNA-hibridisasie onmoontlik sonder om hierdie dinge te verstaan.
Wanneer veelvuldige ribonukleïensuur (of deoksiribonukleïensuur) spesies op hierdie manier vergelyk word, laat die ooreenkomswaardes toe dat die spesie in die filogenetiese boom geplaas word. Daarom is dit een van die moontlike benaderings om molekulêre sistematiek uit te voer. Charles Sibley en John Ahlquist, die pioniers van hierdie tegniek, het DNA-DNA-hibridisasie gebruik om die filogenetiese verwantskappe van voëls (Sibley-Ahlquist-taksonomie) en primate te bestudeer.
Belangrikheid vir biologie
DNA-DNA hibridisasie is die goue standaard vir die onderskeid van bakteriese spesies, met 'n ooreenkomswaarde van meer as 70%, wat aandui dat die vergelykende stamme aan verskillende spesies behoort. In 2014 is 'n drempel van 79% ooreenkoms voorgestel vir die skeiding van 'n bakteriese subspesie.
Kritici beweer dat die tegniek onakkuraat is om naverwante spesies te vergelyk, aangesien enige poging om verskille tussen ortoloë volgordes tussen organismes te meet, oorweldig word deur die verbastering van paraloog eweknieë in 'n organisme se genoom. DNS-volgordebepaling en berekeningsvolgorde-vergelykings is tans die algemeen gebruikte metode vir die bepaling van genetiese afstand, hoewel hierdie benadering steeds in mikrobiologie gebruik word om bakterieë te help identifiseer.
Die huidige manier is om DNA-DNA-hibridisasie in silikoon uit te voer deur gebruik te maak van volledig of gedeeltelik opeenvolgende genome. Die GGDC wat deur die DSMZ ontwikkel is, is die mees akkurate bekende hulpmiddel vir die berekening van DDH-agtige waardes. Onder ander algoritmiese verbeterings los dit die probleem met paraloogvolgorde op deur dit versigtig uit passings tussen twee genoomreekse te filter.
FISH-metode
Fluorescence In Situ Hibridization (FISH) is 'n laboratoriumtegniek wat gebruik word om DNS op te spoor en te volg, dikwels op 'n spesifieke chromosoom.
In 1969 het Joseph Gall en Mary Lou Pardu 'n referaat gepubliseer wat demonstreer dat radioaktiewe kopieë van 'n ribosomale DNS-volgorde gebruik kan word om komplementêre DNS-volgorde in die kern van 'n padda-eier op te spoor. Sedert hierdie oorspronklike waarnemings het baie verfynings die veelsydigheid verhoog endie sensitiwiteit van die prosedure tot so 'n mate dat in situ hibridisering ("in plek", Latyn) nou as 'n belangrike hulpmiddel in sitogenetika beskou word. (Die term in situ word nou ook gebruik om na die aanvanklike stadium van karsinoomgroei te verwys, wanneer slegs epiteelweefsel by die patologiese proses betrokke is.)
Fluorescerende hibridisasievolgorde
RNA-probes kan ontwerp word vir enige geen of enige volgorde binne 'n geen om lncRNA en miRNA mRNA in weefsels en selle te visualiseer. FISH word gebruik deur die siklus van selvoortplanting te bestudeer, veral kerninterfase vir enige chromosomale abnormaliteite. FISH laat jou toe om 'n groot reeks argiefgevalle te ontleed, dit is baie makliker om die geïdentifiseerde chromosoom te identifiseer deur 'n sonde met 'n kunsmatige chromosoombasis te skep wat soortgelyke chromosome sal lok.
Hibridisering seine vir elke sonde wanneer 'n kern abnormaliteit opgespoor word: elke mRNA en lncRNA opsporing sonde bestaan uit 20 pare oligonukleotiede, elke paar dek 'n spasie van 40-50 bp. bl. Probes gebruik eie chemie om mRNA op te spoor.
Hibridisering met DNA-probes
Probes word dikwels gemaak van DNA-fragmente wat geïsoleer, gesuiwer en geamplifiseer is vir gebruik in die ontwerp van die menslike genoom. Die grootte van die menslike genoom is so groot in vergelyking met die lengte wat direk gevolg kan word dat dit nodig is om dit te verdeel infragmente. Uiteindelik is hierdie fragmente georden deur 'n kopie van elke fragment in selfs kleiner eenhede te verteer deur gebruik te maak van volgorde-spesifieke endonukleases om die grootte van elke klein fragment te meet deur gebruik te maak van grootte-uitsluitingschromatografie deur hierdie inligting te gebruik om te bepaal waar groot fragmente met mekaar oorvleuel..
Om die elemente met hul individuele DNA-volgordes te bewaar, is die fragmente by 'n stelsel van immer-herhalende bakteriese populasies gevoeg. Klonale populasies van bakterieë, elke populasie wat 'n enkele kunsmatige chromosoom behou, word in verskeie laboratoriums regoor die wêreld gestoor. Kunsmatige chromosome (BAC's) kan gekweek, onttrek en gemerk word in enige laboratorium wat 'n biblioteek bevat. Genomiese biblioteke word dikwels vernoem na die instellings waar hulle ontwikkel is.’n Voorbeeld is die RPCI-11-biblioteek, vernoem na die Roswell Cancer Institute in Buffalo (New York, VSA). Hierdie fragmente maak ongeveer 100 duisend basispare uit en is die basis van die meeste FISH probes.
