Gram-vlek word wyd in mikrobiologie gebruik, aangesien dit een van die maklikste maniere is om bakterieë te onderskei op grond van die samestelling van hul selwand. Volgens Gram kan alle bakterieë in gram-positief (Gram (+)) en gram-negatief (Gram (-)) verdeel word. Die Gram-kleurmetode is in 1884 ontwikkel en het sedertdien nie gewild geraak nie, hoewel dit verskeie kere gewysig is.
Selmuurstruktuur
Gram-kleuring wys of 'n bakterie Gram-positief of Gram-negatief is. Die verdeling van bakterieë in Gram (+) en Gram (-) word uitgevoer in ooreenstemming met die struktuur van hul selwand.
Die selwand bevat die grootste hoeveelheid peptidoglikaan (mureïen) - 'n komplekse stof, wat peptapeptied en glikaan insluit. Die glikaan bestaan uit afwisselende residue van N-asetielglukosamien en N-asetielmuramiensuur wat aan mekaar gekoppel is deur β-1,4-glikosidiese bindings. Peptidoglycan verskaf selvorminstandhouding, osmotiese beskerming en antigeniese funksies.
Belangrikste verskille tussen Gram-positiewe en Gram-negatiewe bakterieë
Verskillende bakterieë het verskillende peptidoglikaanlaagdiktes. By bakterieë wat as gram-positief geklassifiseer word, wissel dit van 15 tot 80 nm, terwyl dit in gram-negatief van 2 tot 8 nm is. Terselfdertyd het Gram-negatiewe bakterieë 'n spesiale struktuur onder die peptidoglikaanlaag, wat Gram-positiewe bakterieë nie het nie - die periplasmiese ruimte. Hierdie spasie is gevul met hidrolitiese ensieme - β-laktamase, ribonuklease 1, fosfatase. Dit is hierdie ensieme wat verantwoordelik is vir die weerstand van Gram-negatiewe bakterieë teen baie antibiotika.
Die Gram(-)-peptidoglikaanlaag van bakterieë is gebind aan lipopolisakkaried, 'n antigeniese struktuur wat endotoksien bevat. In Gram(+)-bakterieë verrig teichoïensure soortgelyke funksies.
Gram-negatiewe bakterieë het 'n bykomende struktuur - die buitenste membraan.
Die kern van die kleurmetode
Voordat jy begin vlek, word smere van die bestudeerde bakterieë voorberei. Om dit te doen, word water op 'n glasskyfie gedrup en 'n kultuur van mikroörganismes word daar bygevoeg met 'n bakteriese lus. Dan, nadat die water heeltemal droog is, word die smeer vasgemaak - die glasskyfie word verskeie kere oor die brandervlam gedra. Gram-kleuring is meer effektief as lewende bakterieë-kleuring - kleurstofmolekules bind beter aan dooie selle.
Inkleur word in verskeie stadiums gedoen:
- Klein stukkies filtreerpapier word op 'n vaste smeer geplaas en die hoofkleurstof word gegiet - gentiaan violet of metileenblou.
- Na 3-5 minute, verwyder die gekleurde filtreerpapier en vul die smeer met Lugol se oplossing vir 1 minuut. In hierdie geval word die voorbereiding donkerder.
- Die Lugol-oplossing word gedreineer en die smeer word met suiwer etielalkohol behandel: 'n paar druppels word op die voorbereiding gedrup, na 20 sekondes gedreineer. Die prosedure word 2-3 keer herhaal.
- Spoel die toetsskyfie met gedistilleerde water.
- Produseer bykomende kleuring - voltooi die voorbereiding met fuksin. Na 1-2 minute word die kleurstof afgewas.
- Nadat die water droog is, ondersoek die smeer onder 'n mikroskoop. Gram-positiewe bakterieë sal blou-violet wees, Gram-negatiewe bakterieë sal pienk of rooi wees.
Oorsake van verskillende kleurpatrone
Soos hierbo beskryf, vlek Gram-kleuring van bakterieë Gram-positiewe bakterieë blou-violet, terwyl Gram-negatiewe bakterieë rooi of pienk vlek. Die rede vir die differensiële kleuring van bakterieë deur hierdie metode is dat nadat die oplosbare vorm van gentiaanviolet die sel binnegekom het, die kleurstof in die onoplosbare jodiumvorm oorgaan. Tydens die behandeling van bakterieë met etielalkohol word lipiede uit die membraan onttrek onder die werking van hierdie nie-polêre oplosmiddel. Die membraan word dan poreus en is nie meer 'n beduidende versperring vir kleurstofloging nie. Egterpeptidoglikaan is meer bestand teen nie-polêre oplosmiddels, insluitend alkohol. Dit is hy wat die uitwas van die kleurstof keer, so bakterieë met 'n dik mureinlaag word blou-violet (gram-positief), en na behandeling met alkohol verander hulle nie van kleur nie.
Dun mureïne-laag gram-negatiewe bakterieë kan nie die kleurstofmolekules in die sel hou nie, so na die werking van alkohol word hulle kleurloos - vlek gram-negatief.
Na blootstelling van 'n smeer aan fuksin, bly Gram-gekleurde bakterieë blou-violet, terwyl Gram-negatiewe bakterieë pienk-rooi word.
Voorbeelde van Gram(+)- en Gram(-)-bakterieë
Gram-negatiewe bakterieë sluit sianobakterieë, swaelbakterieë, ysterbakterieë, chlamydia, rickettsia, asynbakterieë, baie metielobakterieë, tioniese bakterieë, arsenitobakterieë, karboksibakterieë in.
Bifidobakterieë, baie akwatiese bakterieë, streptokokke en stafilokokke is Gram-positief.
