Proteïen is 'n noodsaaklike komponent van alle organismes. Elkeen van sy molekules bestaan uit een of meer polipeptiedkettings wat uit aminosure bestaan. Alhoewel die inligting wat nodig is vir lewe in DNA of RNA gekodeer word, verrig rekombinante proteïene 'n wye reeks biologiese funksies in organismes, insluitend ensiematiese katalise, beskerming, ondersteuning, beweging en regulering. Volgens hul funksies in die liggaam kan hierdie stowwe in verskillende kategorieë verdeel word, soos teenliggaampies, ensieme, strukturele komponent. Gegewe hul belangrike funksies, is sulke verbindings intensief bestudeer en wyd gebruik.
In die verlede was die belangrikste manier om 'n rekombinante proteïen te verkry om dit van 'n natuurlike bron te isoleer, wat gewoonlik ondoeltreffend en tydrowend is. Onlangse vooruitgang in biologiese molekulêre tegnologie het dit moontlik gemaak om DNA wat vir 'n spesifieke stel stowwe kodeer, te kloneer in 'n uitdrukkingsvektor vir stowwe soos bakterieë, gis, insekselle en soogdierselle.
Eenvoudig gestel, rekombinante proteïene word deur eksogene DNS-produkte vertaal inlewende selle. Om dit te kry, behels gewoonlik twee hoofstappe:
- Kloning van 'n molekule.
- Proteïenuitdrukking.
Tans is die vervaardiging van so 'n struktuur een van die kragtigste metodes wat in medisyne en biologie gebruik word. Die samestelling het 'n wye toepassing in navorsing en biotegnologie.
Mediese rigting
Rekombinante proteïene verskaf belangrike behandelings vir verskeie siektes soos diabetes, kanker, aansteeklike siektes, hemofilie en anemie. Tipiese formulerings van sulke stowwe sluit in teenliggaampies, hormone, interleukiene, ensieme en antikoagulante. Daar is 'n groeiende behoefte aan rekombinante formulerings vir terapeutiese gebruik. Hulle laat jou toe om behandelingsmetodes uit te brei.
geneties gemanipuleerde rekombinante proteïene speel 'n sleutelrol in die terapeutiese geneesmiddelmark. Soogdierselle produseer tans die meeste terapeutiese middels omdat hul formulerings in staat is om hoë kwaliteit, natuurlike-agtige stowwe te produseer. Daarbenewens word baie goedgekeurde rekombinante terapeutiese proteïene in E. coli geproduseer as gevolg van goeie genetika, vinnige groei en hoë produktiwiteit. Dit het ook 'n positiewe uitwerking op die ontwikkeling van middels wat op hierdie stof gebaseer is.
Navorsing
Die verkryging van rekombinante proteïene is gebaseer op verskillende metodes. Stowwe help om die basiese en fundamentele beginsels van die liggaam uit te vind. Hierdie molekules kan gebruik word om te identifiseer en te bepaalligging van die stof wat deur 'n spesifieke geen gekodeer word, en om die funksie van ander gene in verskeie sellulêre aktiwiteite te openbaar soos selsein, metabolisme, groei, replikasie en dood, transkripsie, vertaling en modifikasie van die verbindings wat in die artikel bespreek word.
Dus, die waargenome samestelling word dikwels gebruik in molekulêre biologie, selbiologie, biochemie, strukturele en biofisiese studies en baie ander velde van wetenskap. Terselfdertyd is die verkryging van rekombinante proteïene 'n internasionale praktyk.
Sulke verbindings is nuttige hulpmiddels om intersellulêre interaksies te verstaan. Hulle het bewys effektief in verskeie laboratoriummetodes soos ELISA en immunohistochemie (IHC). Rekombinante proteïene kan gebruik word om ensiemtoetse te ontwikkel. Wanneer dit in kombinasie met 'n paar toepaslike teenliggaampies gebruik word, kan selle as standaarde vir nuwe tegnologieë gebruik word.
Biotegnologie
Rekombinante proteïene wat 'n aminosuurvolgorde bevat, word ook in die industrie, voedselproduksie, landbou en bio-ingenieurswese gebruik. Byvoorbeeld, in veeteelt kan ensieme by voedsel gevoeg word om die voedingswaarde van voerbestanddele te verhoog, koste en vermorsing te verminder, diere se dermgesondheid te ondersteun, produktiwiteit te verbeter en die omgewing te verbeter.
Boonop melksuurbakterieë (LAB) vir 'n lang tydis gebruik om gefermenteerde voedsel te produseer, en onlangs is LAB ontwikkel vir die uitdrukking van rekombinante proteïene wat 'n aminosuurvolgorde bevat, wat wyd gebruik kan word, byvoorbeeld om menslike, dierlike en voedingsvertering te verbeter.
Hierdie stowwe het egter ook beperkings:
- In sommige gevalle is die produksie van rekombinante proteïene kompleks, duur en tydrowend.
- Stowwe wat in selle geproduseer word, pas dalk nie by natuurlike vorms nie. Hierdie verskil kan die doeltreffendheid van terapeutiese rekombinante proteïene verminder en selfs newe-effekte veroorsaak. Boonop kan hierdie verskil die resultate van eksperimente beïnvloed.
- Die hoofprobleem met alle rekombinante middels is immunogenisiteit. Alle biotegnologieprodukte kan een of ander vorm van immunogenisiteit toon. Dit is moeilik om die veiligheid van nuwe terapeutiese proteïene te voorspel.
Oor die algemeen het vooruitgang in biotegnologie die produksie van rekombinante proteïene vir 'n verskeidenheid toepassings verhoog en vergemaklik. Alhoewel dit steeds 'n paar nadele het, is die stowwe belangrik in medisyne, navorsing en biotegnologie.
Siekteskakel
rekombinante proteïen is nie skadelik vir mense nie. Dit is slegs 'n integrale deel van die algehele molekule in die ontwikkeling van 'n bepaalde geneesmiddel of voedingselement. Baie mediese studies het getoon dat gedwonge uitdrukking van die FGFBP3-proteïen (afgekort BP3) in 'n laboratoriumstam van vetsugtige muise 'n beduidende vermindering in hul liggaamsvet getoon het.massa, ten spyte van die genetiese aanleg om te gebruik.
Die resultate van hierdie proewe toon dat die FGFBP3-proteïen 'n nuwe terapie kan bied vir versteurings wat met metaboliese sindroom geassosieer word, soos tipe 2-diabetes en vetterige lewersiekte. Maar omdat BP3 'n natuurlike proteïen is en nie 'n kunsmatige middel nie, kan kliniese proewe van rekombinante menslike BP3 begin ná die finale rondte van prekliniese studies. Op, dit wil sê, daar is redes wat verband hou met die veiligheid van die uitvoering van sulke studies. Die rekombinante proteïen is nie skadelik vir mense nie as gevolg van die stapsgewyse verwerking en suiwering daarvan. Veranderinge vind ook op molekulêre vlak plaas.
PD-L2, een van die sleutelspelers in immunoterapie, is genomineer vir die 2018 Nobelprys in Fisiologie of Geneeskunde. Hierdie werk, wat begin is deur prof. James P. Allison van die VSA en prof. Tasuku Honjo van Japan, het gelei tot die behandeling van kankers soos melanoom, longkanker en ander gebaseer op kontrolepunt-immunoterapie. Onlangs het AMSBIO 'n groot nuwe produk by sy immunoterapie-reeks gevoeg, die PD-L2/TCR-aktiveerder - CHO Recombinant Cell Line.
In bewys-van-konsep-eksperimente het navorsers aan die Universiteit van Alabama in Birmingham, gelei deur H. Long Zheng, besturende direkteur, professor Robert B. Adams, en Direkteur van Laboratoriumgeneeskunde, Departement Patologie, UAB Skool van Medisyne, het 'n moontlike terapie uitgelig, 'n seldsame maar dodelike bloedingsversteuring, TTP.
Die resultate hiervanstudies toon vir die eerste keer dat oortapping van rADAMTS13-gelaaide bloedplaatjies 'n nuwe en potensieel effektiewe terapeutiese benadering kan wees vir arteriële trombose wat met aangebore en immuun-gemedieerde TTP geassosieer word.
Rekombinante proteïen is nie net 'n voedingstof nie, maar ook 'n geneesmiddel in die samestelling van die geneesmiddel wat ontwikkel word. Hierdie is net 'n paar gebiede wat nou by medisyne betrokke is en verband hou met die studie van al sy strukturele elemente. Soos internasionale praktyk toon, maak die struktuur van 'n stof dit op molekulêre vlak moontlik om baie ernstige probleme in die menslike liggaam te hanteer.
Entstofontwikkeling
'n Rekombinante proteïen is 'n spesifieke stel molekules wat gemodelleer kan word. 'n Soortgelyke eienskap word gebruik in die ontwikkeling van entstowwe.’n Nuwe inentingstrategie, ook bekend as die gebruik van’n spesiale rekombinante virus-inspuiting, kan miljoene hoenders wat gevaar loop teen’n ernstige respiratoriese siekte beskerm, het navorsers van die Universiteit van Edinburgh en die Pirbright-instituut gesê. Hierdie entstowwe gebruik onskadelike of swak weergawes van 'n virus of bakterie om kieme in die liggaam se selle in te voer. In hierdie geval het kenners rekombinante virusse met verskillende piekproteïene as entstowwe gebruik om twee weergawes van 'n onskadelike virus te skep. Daar is baie verskillende dwelms wat rondom hierdie verband gebou is.
Rekombinante proteïenhandelsname en analoë is soos volg:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Dit is hoofsaaklik teenkankermiddels, maar daar is ander behandelingsareas wat met hierdie aktiewe stof geassosieer word.
'n Nuwe entstof, ook genoem LASSARAB, wat ontwerp is om mense teen beide Lassa-koors en hondsdolheid te beskerm, het belowende resultate in prekliniese studies getoon, volgens 'n nuwe studie gepubliseer in die wetenskaplike joernaal Nature Communications. 'n Geïnaktiveerde rekombinante entstofkandidaat gebruik 'n verswakte hondsdolheidvirus.
Die navorsingspan het Lassa-virus-genetiese materiaal in 'n hondsdolheid-virusvektor ingevoeg sodat die entstof oppervlakproteïene in beide Lassa- en hondsdolheid-selle sou uitdruk. Hierdie oppervlakverbindings ontlok 'n immuunrespons teen aansteeklike middels. Hierdie entstof is toe geïnaktiveer om die lewende hondsdolheidvirus te "vernietig" wat gebruik is om die draer te maak.
Kry metodes
Daar is verskeie stelsels vir die vervaardiging van 'n stof. Die algemene metode vir die verkryging van 'n rekombinante proteïen is gebaseer op die verkryging van biologiese materiaal uit die sintese. Maar daar is ander maniere.
Daar is tans vyf hoofuitdrukkingstelsels:
- E. coli-uitdrukkingstelsel.
- Gis-uitdrukkingstelsel.
- Insekseluitdrukkingstelsel.
- Soogdiersel-uitdrukkingstelsel.
- Selvrye proteïenuitdrukkingstelsel.
Laasgenoemde opsie is veral geskik vir die uitdrukking van transmembraanproteïeneen giftige verbindings. In onlangse jare is stowwe wat moeilik is om uit te druk deur konvensionele intrasellulêre metodes suksesvol geïntegreer in selle in vitro. In Wit-Rusland word die produksie van rekombinante proteïene wyd gebruik. Daar is 'n aantal staatsbeheerde ondernemings wat met hierdie kwessie te doen het.
Selvrye proteïensintesestelsel is 'n vinnige en doeltreffende metode om teikenstowwe te sintetiseer deur verskeie substrate en energieverbindings by te voeg wat nodig is vir transkripsie en translasie in die ensiematiese stelsel van sellulêre ekstrakte. In onlangse jare het die voordele van selvrye metodes vir tipes stowwe soos komplekse, giftige membrane geleidelik na vore gekom, wat hul potensiële toepassing in die biofarmaseutiese veld demonstreer.
Selvrye tegnologie kan 'n verskeidenheid nie-natuurlik-voorkomende aminosure maklik en op 'n beheerde wyse byvoeg om komplekse modifikasieprosesse te bereik wat moeilik is om op te los na konvensionele rekombinante uitdrukking. Sulke metodes het 'n hoë toepassingswaarde en potensiaal vir geneesmiddellewering en entstofontwikkeling deur virusagtige deeltjies te gebruik. 'n Groot aantal membraanproteïene is suksesvol in vrye selle uitgedruk.
Uitdrukking van komposisies
Rekombinante proteïen CFP10-ESAT 6 word geproduseer en gebruik om entstowwe te skep. So 'n tuberkulose-allergeen laat jou toe om die immuunstelsel te versterk en teenliggaampies te ontwikkel. In die algemeen behels molekulêre studies die studie van enige aspek van 'n proteïen, soos struktuur, funksie, modifikasies, lokalisering of interaksies. Te verkenhoe spesifieke stowwe interne prosesse reguleer, benodig navorsers gewoonlik die middele om funksionele verbindings van belang en voordeel te produseer.
Gegewe die grootte en kompleksiteit van proteïene, is chemiese sintese nie 'n lewensvatbare opsie vir hierdie poging nie. In plaas daarvan word lewende selle en hul sellulêre masjinerie gewoonlik as fabrieke gebruik om stowwe te skep en te bou gebaseer op die verskafde genetiese sjablone. Die rekombinante proteïen-uitdrukkingstelsel genereer dan die nodige struktuur om 'n geneesmiddel te skep. Vervolgens kom die keuse van die nodige materiaal vir verskillende kategorieë dwelms.
Anders as proteïene, is DNA maklik om sinteties of in vitro te konstrueer deur gebruik te maak van goed gevestigde rekombinante tegnieke. Daarom kan DNS-sjablone van spesifieke gene, met of sonder bygevoegde verslaggewervolgorde of affiniteitmerkervolgorde, ontwerp word as sjablone vir uitdrukking van die gemonitorde stof. Sulke verbindings wat van sulke DNA-sjablone afkomstig is, word rekombinante proteïene genoem.
Tradisionele strategieë vir uitdrukking van 'n stof behels die transfektering van selle met 'n DNA-vektor wat 'n sjabloon bevat en dan die selle te kweek om die verlangde proteïen te transkribeer en te vertaal. Tipies word die selle dan gelys om die uitgedrukte verbinding te onttrek vir daaropvolgende suiwering. Die rekombinante proteïen CFP10-ESAT6 word op hierdie manier verwerk en gaan deur 'n suiweringstelsel vanaf moontlikedie vorming van gifstowwe. Eers daarna gaan dit tot 'n entstof gesintetiseer word.
Beide prokariotiese en eukariotiese in vivo uitdrukkingstelsels vir molekulêre stowwe word wyd gebruik. Die keuse van stelsel hang af van die tipe proteïen, die vereiste vir funksionele aktiwiteit en die verlangde opbrengs. Hierdie uitdrukkingstelsels sluit soogdiere, insekte, giste, bakterieë, alge en selle in. Elke stelsel het sy eie voordele en uitdagings, en die keuse van die regte stelsel vir 'n spesifieke toepassing is belangrik vir die suksesvolle uitdrukking van die stof wat hersien word.
Uitdrukking deur soogdiere
Die gebruik van rekombinante proteïene laat die ontwikkeling van entstowwe en middels van verskillende vlakke toe. Hiervoor kan hierdie metode om 'n stof te verkry, gebruik word. Soogdieruitdrukkingstelsels kan gebruik word om proteïene uit die diereryk te produseer wat die mees inheemse struktuur en aktiwiteit het as gevolg van hul fisiologies relevante omgewing. Dit lei tot hoë vlakke van post-translasionele verwerking en funksionele aktiwiteit. Soogdieruitdrukkingstelsels kan gebruik word om teenliggaampies, komplekse proteïene en verbindings te produseer vir gebruik in selgebaseerde funksionele toetse. Hierdie voordele gaan egter gepaard met strenger kultuurvoorwaardes.
Soogdieruitdrukkingstelsels kan gebruik word om proteïene kortstondig of deur stabiele sellyne te genereer waar die uitdrukkingskonstruk in die gasheergenoom geïntegreer is. Terwyl sulke stelsels in verskeie eksperimente gebruik kan word, is die tydproduksie kan 'n groot hoeveelheid stof in een tot twee weke genereer. Hierdie tipe rekombinante proteïenbiotegnologie is in groot aanvraag.
Hierdie verbygaande, hoë-opbrengs soogdier-uitdrukkingstelsels gebruik suspensiekulture en kan gram per liter lewer. Boonop het hierdie proteïene meer inheemse vou en post-translasionele modifikasies soos glikosilering in vergelyking met ander uitdrukkingstelsels.
Insekuitdrukking
Metodes vir die vervaardiging van rekombinante proteïen is nie beperk tot soogdiere nie. Daar is ook meer produktiewe maniere wat produksiekoste betref, alhoewel die opbrengs van die stof per 1 liter behandelde vloeistof baie laer is.
Insekselle kan gebruik word om 'n hoëvlak proteïen uit te druk met modifikasies soortgelyk aan soogdierstelsels. Daar is verskeie stelsels wat gebruik kan word om rekombinante baculovirus te genereer, wat dan gebruik kan word om die stof van belang in insekselle te onttrek.
Uitdrukkings van rekombinante proteïene kan maklik opgeskaal en aangepas word vir hoëdigtheid suspensiekultuur vir grootskaalse samestelling van molekules. Hulle is meer funksioneel soortgelyk aan die inheemse samestelling van soogdiermateriaal. Alhoewel die opbrengs tot 500 mg/L kan wees, kan die produksie van rekombinante baculovirus tydrowend wees en kweektoestande is moeiliker as prokariotiese sisteme. Maar in meer suidelike en warmer lande, 'n soortgelykemetode word as meer doeltreffend beskou.
Bakteriese uitdrukking
Produksie van rekombinante proteïene kan met behulp van bakterieë gevestig word. Hierdie tegnologie verskil baie van dié wat hierbo beskryf is. Bakteriële proteïen-uitdrukkingstelsels is gewild omdat die bakterieë maklik is om te kweek, vinnig groei en hoë opbrengste van die rekombinante formulering lewer. Multidomein-eukariotiese stowwe wat in bakterieë uitgedruk word, is egter dikwels nie-funksioneel omdat selle nie toegerus is om die nodige post-translasie-modifikasies of molekulêre vou uit te voer nie.
Boonop word baie proteïene onoplosbaar as insluitingmolekules, wat baie moeilik is om te herwin sonder harde denatureerders en daaropvolgende omslagtige molekulêre hervouprosedures. Hierdie metode word meestal as steeds grootliks eksperimenteel beskou.
Selvrye uitdrukking
Rekombinante proteïen wat die aminosuurvolgorde van stafilokinase bevat, word op 'n effens ander manier verkry. Dit is ingesluit in baie soorte inspuitings, wat verskeie stelsels benodig voor gebruik.
Selvrye proteïenuitdrukking is 'n in vitro-sintese van 'n stof wat translasieversoenbare heelselekstrakte gebruik. In beginsel bevat heelselekstrakte al die makromolekules en komponente wat benodig word vir transkripsie, vertaling en selfs post-translasiemodifikasie.
Hierdie komponente sluit RNA-polimerase, regulatoriese proteïenfaktore, transkripsievorme, ribosome en tRNA in. By die byvoegingkofaktore, nukleotiede en 'n spesifieke geen-sjabloon, kan hierdie ekstrakte proteïene van belang binne 'n paar uur sintetiseer.
Alhoewel dit nie volhoubaar is vir grootskaalse produksie nie, bied selvrye of in vitro proteïenuitdrukking (IVT) stelsels 'n aantal voordele bo konvensionele in vivo stelsels.
Selvrye uitdrukking laat vinnige sintese van rekombinante formulerings toe sonder om selkultuur te betrek. Selvrye sisteme maak dit moontlik om proteïene met gemodifiseerde aminosure te merk, asook om verbindings uit te druk wat vinnige proteolitiese afbraak deur intrasellulêre proteases ondergaan. Daarbenewens is dit makliker om baie verskillende proteïene gelyktydig uit te druk deur 'n selvrye metode te gebruik (byvoorbeeld om proteïenmutasies te toets deur kleinskaalse uitdrukking vanaf baie verskillende rekombinante DNA-sjablone). In hierdie verteenwoordigende eksperiment is die IVT-stelsel gebruik om die menslike kaspase-3-proteïen uit te druk.
Gevolgtrekkings en toekomsvooruitsigte
Rekombinante proteïenproduksie kan nou as 'n volwasse dissipline gesien word. Dit is die resultaat van talle inkrementele verbeterings in suiwering en ontleding. Tans word medisyne-ontdekkingsprogramme selde gestaak as gevolg van die onvermoë om die teikenproteïen te produseer. Parallelle prosesse vir die uitdrukking, suiwering en ontleding van verskeie rekombinante stowwe is nou bekend in baie laboratoriums regoor die wêreld.
Proteïenkomplekse en groeiende sukses in die maakoplosbare membraanstrukture sal meer veranderinge vereis om tred te hou met die vraag. Die opkoms van effektiewe kontraknavorsingsorganisasies vir 'n meer gereelde voorsiening van proteïene sal die hertoewysing van wetenskaplike hulpbronne moontlik maak om hierdie nuwe uitdagings die hoof te bied.
Boonop behoort parallelle werkvloeie die skepping van volledige biblioteke van die gemonitorde stof moontlik te maak om nuwe teikenidentifikasie en gevorderde sifting moontlik te maak, tesame met tradisionele kleinmolekule-medisynontdekkingsprojekte.
