Kweek van bakterieë: metodes, beginsels, stappe en toestande

2024 Outeur: Angel Austin | [email protected]. Laas verander: 2023-12-17 05:14

Mikro-organismes in die natuur om ons is oral: in grond, waterliggame, op die oppervlaktes van verskeie voorwerpe, word mense en diere deur hulle bewoon. Dit alles kan dien as bronne van mikrobiese kontaminasie van voedsel, dwelms en produksielyne. Die kweek van bakterieë is nodig om hul eienskappe, behoeftes en eienskappe te bestudeer. Dit is op sy beurt 'n belangrike stap in die ontwikkeling van verskeie middels, laboratoriumdiagnose van siektes, die berekening van produksiereaktore en nog baie meer.

Algemene konsepte

Kweek van bakterieë in mikrobiologie verwys na die kweek van mikroörganismes wat in die laboratorium uitgevoer word. Op hul beurt word mikrobes wat op 'n geselekteerde voedingsmedium gegroei het, 'n kultuur genoem. Kulture kan gemeng word as hulle deur verskillende tipes mikroörganismes gevorm word, en suiwer as hulle slegs deur een tipe bakterieë verteenwoordig word.

Indien voedingswaardeSlegs een sel word in die medium geplaas, en 'n groep individue word verkry as gevolg van sy voortplanting, dan word hierdie stel mikroörganismes 'n kloon genoem. Wanneer 'n kloon ontwikkel tot die punt waar dit met die blote oog sigbaar word, word hierdie versameling bakterieë 'n kolonie genoem.

Gewoonlik word die verbouing van bakterieë wat uit verskillende bronne geïsoleer is, apart van mekaar uitgevoer. Elke so 'n afsonderlik gekweekte groep mikrobes word 'n stam genoem. Dus, as een tipe stafilokokke uit drie bronne geïsoleer word (of verskillende gedeeltes van dieselfde produk, verskillende mense), praat hulle van drie stamme van hierdie tipe stafilokokke.

Bakteriegroeifaktore

Dit sluit verskeie aminosure, lipiede, purienbasisse en ander verbindings in wat nodig is vir die ontwikkeling van mikroörganismes. Sommige mikrobes kan onafhanklik die stowwe produseer wat hulle benodig, terwyl ander dit in voltooide vorm moet ontvang. Volgens die behoeftes van mikroörganismes in sekere groeifaktore, word identifikasie en differensiasie van bakterieë uitgevoer. Hierdie parameter is ook belangrik vir die korrekte voorbereiding van 'n voedingsmedium vir laboratorium- en biotegnologiese werk:

• Aminosure. Bakterieë kan een spesifieke aminosuur of groep sure benodig. Dus, clostridia het leusien en tirosien nodig, streptokokke het leusien en arginien nodig. Mikro-organismes wat aminosure van buite benodig om te groei, word eksotrofe genoem.
• Purien- en pirimidienbasisse, sowel as hul afgeleides (adenien, guanien en ander). Hulle is 'n belangrike faktor in die groei van baieStreptococcus spesies.
• Vitamiene. Hulle is deel van die koënsieme wat deur bakterieë benodig word. Dus, nikotiensuur, sowel as sy amied, wat deel is van NAD en NADP, word benodig deur witseerkeel en shigella corynebacteria. Tiamien, as 'n integrale deel van pirofosfaat, word benodig deur Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Pantoteensuur, wat deel is van die KoA-koënsiem, word deur tetanusbasille en sekere soorte streptokokke benodig. Sitochrome, en dus die foliensuur, heemse en biotien wat dit vorm, is nodig vir Mycobacterium tuberculosis en Haemophilus influenzae.

Omgewingsvereistes

Voorwaardes vir kweekmedia vir die kweek van bakterieë:

1. Voeding. Hulle moet boonop stowwe in 'n maklik verteerbare vorm bevat wat nodig is vir mikroörganismes om te voed en energie aan te vul. Dit sluit organogene en minerale in. Sommige mikroörganismes benodig ook vitamiene en aminosure wat hulle nie kan sintetiseer nie.
2. Optimale pH-vlak. Dit beïnvloed die deurlaatbaarheid van die selmembraan en gevolglik die vermoë om voedingstowwe deur die bakterie te absorbeer. Meestal moet die pH-waarde op die vlak van 7, 2-7, 4 wees. Baie mikroörganismes produseer in die loop van hul lewe produkte met suur of alkaliese reaksies, en sodat die pH van die voedingsmedium nie verander nie, dit moet gebuffer word.
3. Isotonies. Die osmotiese druk in die voedingsmedium vir die kweek van bakterieë moet dieselfde waardes hê asbinne mikrobiese selle. Dit stem gewoonlik ooreen met 'n 0,5% NaCl-oplossing.
4. Steriliteit. Dit is te wyte aan die feit dat die voorkoms van vreemde bakterieë die resultate van die studie van die geanaliseerde stam sal verwring.
5. Humiditeitsvlak. Hierdie aanwyser, tesame met die konsekwentheid van die medium, behoort optimale eienskappe vir 'n bepaalde tipe bakterieë te hê.
6. Redox-potensiaal (RH2). Dit toon die verhouding van stowwe wat elektrone skenk en aanvaar, sowel as die vlak van suurstofversadiging van die voedingsmedium. Vir aërobe en anaërobe verskil die toestande vir die kweek van bakterieë ietwat in hierdie aanwyser. Anaërobiese mikroörganismes reproduseer die beste by RH2-waardes onder 5 en aërobiese mikroörganismes ten minste 10.
7. Eenvormigheid. Dit is belangrik dat die kweekmedium konstante hoeveelhede van sy individuele bestanddele bevat. Daarbenewens word duidelike oplossings verkies, wat dit makliker maak om gewasgroei te monitor of kontaminasie op te merk.

Soorte kultuurmedia

Die keuse van 'n spesifieke medium vir die kweek van mikroörganismes word deur baie faktore beïnvloed, waaronder die kenmerke van hul voeding en die doel van die studie. Die hoofkenmerke onderliggend aan die klassifikasie van voedingsmedia is:

1. Komponente. Volgens die aanvanklike stowwe wat gebruik word om die substraat te skep, onderskei hulle:

• natuurlik, wat berei word uit produkte van dierlike of plantaardige oorsprong (bv. vleis, melk, vrugte) en geskik is om gemeng te kweekoeste;
• semi-sinteties, waarin duur natuurlike voedselprodukte vervang word deur nie-voedselprodukte (byvoorbeeld beenmeel, bloedklonte), en wat optimaal is vir die kweek van sekere tipes bakterieë of om hul metaboliese produkte te isoleer van die omgewing;
• sintetiese, wat uit presiese hoeveelhede chemiese verbindings berei word, het 'n bekende konstante samestelling en is maklik reproduseerbaar.

2. Konsekwentheid (digtheid). Onderskei omgewings:

• vloeistof;
• digte;
• semi-vloeistof.

Die laaste twee word voorberei uit spesiale oplossings of vloeibare stowwe met die byvoeging van agar-agar of gelatien om die vereiste digtheid te skep. Boonop is 'n digte omgewing vir die groei van bakterieë gestolde bloedserum, aartappels, silikagelmedia, karrageen.

3. Saamgestelde. Op hierdie basis is die omgewings:

• eenvoudig, waarvan die lys kort is, is Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), voedingstofgelatien en peptoonwater.
• kompleks, voorberei uit eenvoudiges met die byvoeging van bloed, wei, koolhidrate en ander stowwe.

4. Afspraak. Die volgende voedingstowwe word onderskei:

• main word gebruik om baie patogene mikrobes te kweek (gewoonlik eenvoudige samestelling);
• spesiale word gebruik om bakterieë te isoleer en te kweek wat nie op eenvoudige substrate groei nie;
• selektief (hulle is ook selektief) is geskik vir die isolering van 'n spesifieke tipe bakterieë en inhibeer die groei van geassosieerde mikrobes (selektiwiteitgeskep deur sekere stowwe by die media te voeg, soos antibiotika of soute, of deur die pH aan te pas);
• differensiële diagnostiek maak dit moontlik om een tipe bakterieë van 'n ander te onderskei deur die ensiematiese aktiwiteit, byvoorbeeld, van die medium te assesseer;
• preserveermiddels word benodig vir aanvanklike inenting met daaropvolgende vervoer van monsters, aangesien dit die dood van mikroörganismes voorkom, asook die groei van ander bakterieë inhibeer.

Mediavoorbereiding

Die belangrikste stap in die kweek van anaërobiese bakterieë is die voorbereiding van 'n geskikte voedingsmedium. Nadat die optimale parameters gekies is, gaan voort na die volgende stadiums:

• weeg, deur 'n monster van komponente op 'n analitiese balans te kies;
• ontbinding uitgevoer in gedistilleerde water wat tot 70 ° C verhit is, en fosfate, mikro- en makrosoute word apart opgelos;
• kook in 'n waterbad vir twee minute;
• pH-bepaling deur aanwyserpapier of potensiometer;
• filtrasie deur nat lap- of papierfilters vir vloeibare sowel as gesmelte digte media, en deur 'n katoengaasfilter vir agarmedia;
• bottelering uitgevoer op 3/4 kapasiteit;
• medium afhanklike sterilisasie;
• beheer vir steriliteit word uitgevoer deur twee dae lank in 'n termostaat te sit, gevolg deur kyk;
• chemiese beheer om die pH en inhoud van die nodige vas te stelitems;
• biologiese beheer deur proefinokulasie.

Sterilisasie van glasware en media

Een van die basiese beginsels van bakteriese verbouing is steriliteit. Die groei en ontwikkeling van vreemde mikroörganismes kan die eienskappe van die voedingsmedium beïnvloed deur die chemiese samestelling en pH daarvan te verander. Sterilisasie is die hoofvoorwaarde vir die groei van suiwer kulture. In die praktyk beteken hierdie term die metodes van vernietiging van absoluut alle lewensvorme op die oppervlak en in die volume van gesteriliseerde voorwerpe. Skepe, instrumente wat gebruik word, media en ander items wat tydens die studie gebruik is, word gesteriliseer.

Sommige tipes sterilisasie:

• Ignition. Sterilisasie van lusse en naalde vir saai, glasskyfies, sommige instrumente kan met 'n brander of spirituslamp uitgevoer word.
• Kook. Geskik vir die hantering van spuite, naalde, kos, maar maak nie bakteriese spore dood nie.
• Droë hitte sterilisasie. Dit word in 'n spesiale droogkas uitgevoer en is geskik vir die verwerking van flesse, proefbuise en ander laboratoriumglasware.
• Stoomsterilisasie. Uitgevoer in 'n outoklaaf, is hierdie metode hoogs effektief. Maar dit is nie geskik vir voedingsmedia wat proteïene of enige ander verbindings bevat wat by hoë temperature afbreek nie. Meer spaarsamig kan tyndalisering genoem word. Dit word in die Koch-ketel uitgevoer en kombineer die ontkieming van spore met hul vernietiging.
• Pasteurisasie. Dit word gebruik vir media wat hul eienskappe verander wanneer dit gekook word (byvoorbeeld melk, wyn, bier), in staat omontslae te raak van nie-spoor-draende mikroörganismes. Die verwerkingstemperatuur is slegs 50-60 ° C vir vyftien tot dertig minute. In sommige gevalle word koue sterilisasie gebruik, uitgevoer met behulp van filters of UV-strale.

Bakterieverbouingstoestande

Die groei en ontwikkeling van bakterieë is slegs moontlik onder sekere faktore en die waardes van elk van hulle:

1. Temperatuur. Daar is drie groepe bakterieë wat verskil in temperatuurvoorkeure:

• termofiele, of hitte-liefdevolle mikrobes, groei teen 45-90°C, wat beteken dat hulle nie in menslike en dierlike organismes vermeerder nie;
• psigrofiele, of koue-liefdevolle mikroörganismes, verkies temperature in die reeks van 5-15 ° C en word in koelkamers gekweek;
• mesofiele, ontwikkel by 'n temperatuur van 25-37 ° C, hulle sluit die meeste bakterieë in.

2. Lig. Dit is 'n kenmerk van die kweek van fototrofiese bakterieë, aangesien hulle die fotosintetiese proses uitvoer. Maar vir die meeste mikrobes is beligting nie 'n voorvereiste nie. En selfs andersom, ultraviolet sonkrag kan hul ontwikkeling onderdruk.

3. Water. Alle mikroörganismes benodig water in 'n toeganklike (vloeibare) vorm. Dis hoekom bevrore kos min tot geen bakterieëgroei het nie.

4. Suurheid van die omgewing. Hierdie beginsel van die kweek van bakterieë is reeds hierbo breedvoerig bespreek.

5. Belugting. Suurstof, as 'n chemiese element, is 'n integrale deel van water en 'n aansienlike aantal verbindings wat daarvoor gebruik wordkweek van mikroörganismes. Gasvormige suurstof kan ook in water en ander vloeistowwe in opgeloste vorm voorkom. 'n Beduidende deel van bakterieë benodig 'n konstante toevoer van suurstofmolekules. Maar vir 'n aantal mikroörganismes is dit onnodig, of, erger, gasvormige suurstof is giftig vir hulle, aangesien hulle nie katalase en peroksidase het nie, wat giftige respiratoriese produkte vernietig. Daarom is die belangrikste stap in die kweek van anaërobiese bakterieë die verwydering van O₂ molekules uit die voedingsmedium.

6. Kweek van mikroörganismes. Die verbouing van aërobiese en anaërobiese bakterieë word in verskillende lae van die omgewing en op verskillende maniere uitgevoer.

Kweek van aërobiese mikroörganismes

Kweek van aërobiese bakterieë vereis molekulêre suurstof. Om suiwer kulture van aerobes te verkry wat suksesvol in medisyne en die voedselindustrie gebruik kan word, word die volgende metodes gebruik:

• oppervlak wat op digte media of in vloeibare media (hul dun laag) groei wanneer suurstof direk uit die lug kom;
• diep bewerking in vloeibare media, wanneer 'n toename in die hoeveelheid suurstof daarin opgelos word deur konstante deurlugting.

Kweek van anaërobiese mikroörganismes

Die basiese beginsel van die kweek van bakterieë van hierdie tipe is hul minimale kontak met atmosferiese suurstof. Die verskaffing van toestande vir hul groei is baie moeiliker as vir aerobes. Die volgende metodes word gebruik om anaërobe van molekulêre O₂ te isoleer:

1. Fisiek. Hierdie metode van verbouing van anaërobiese bakterieë word verminder tot hul verbouing in 'n spesiale vakuumapparaat - 'n mikroanaerostaat. Die lug daarin word vervang deur 'n spesiale gasmengsel van stikstof met die byvoeging van 10% waterstof en 5% koolstofdioksied.
2. Chemies. Dit sluit in: gebruik van absorberende middels (bv. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) of reduseermiddels (soos askorbiensuur).
3. Biologiese. Dit kom neer op die gesamentlike kweek van aërobe en anaërobe in 'n geslote sisteem. Hierdie metode om bakterieë te kweek behels die saai van die een helfte van 'n Petri-skottel met sommige van die aërobiese spesies bakterieë, en die ander helfte met die bestudeerde anaërobe. Die ontwikkeling daarvan sal begin op die oomblik wanneer al die suurstof opgebruik is.

Die volgende saaimetodes is geskik vir die kweek van anaërobiese bakterieë:

• in die oppervlaklaag;
• in die oppervlaklaag gevul met steriele paraffien;
• in die dik van 'n digte voedingsmedium;
• in diep lae viskose media.

Verkryging van suiwer kultuur

Mikrobioloë werk gewoonlik met monsters wat deur baie verskillende soorte mikrobes bewoon word. Om die sistematiese posisie van mikroörganismes (familie, genus, spesie) te bepaal, asook om hul eienskappe te bestudeer, is dit egter nodig om hulle te isoleer en 'n suiwer kultuur te kweek. Hulle is van groot belang in baie voedselbedrywe, byvoorbeeld kaas, brood, kwas, wyn, ens. Die verbouing van melksuurbakterieë maak dit moontlik om te verkry'n noodsaaklike komponent vir die produksie van gefermenteerde melkprodukte, deeg, kakao, kuilvoer en selfs plastiek.

Die metode om 'n suiwer kultuur in 'n digte medium te isoleer is gebaseer op die meganiese skeiding van mikroörganismeselle met hul daaropvolgende geïsoleerde verbouing. Die monster word oorgedra in 'n steriele volume water of soutoplossing (volume 10-100 ml) en dan vir twee minute geskud. Om mikroörganismes wat in die dikte van die materiaal wat bestudeer word, te onttrek (byvoorbeeld worsies of kaas), word eers die monsterstukke met steriele instrumente met sand gevryf. Die materiaal wat voorlopige voorbereiding ondergaan het, wat 1 g weeg of 'n volume van 1 ml, word 10, 100, 1000, ens. keer verdun met steriele water. Die mate van verdunning word gekies wat 'n konsentrasie selle gee wat ooreenstem met die vermoëns van die metode.

Die daaropvolgende verbouing van mikroörganismes is om 'n voedingsmedium voor te berei. Gewoonlik word 'n digte medium (MPA) gekies. Dit word eers gesmelt en afgekoel tot 45-50 °C, en eers daarna word dit in verskeie Petri-skottels (drie tot vyf stukke) gegooi, op die bodem waarvan deppers van die toetsstof van verskillende konsentrasies geplaas word. Vervolgens word die vermenging van die steeds nie-bevrore voedingsmedium en die materiaal wat daarin ingebring is, uitgevoer. Dit is hoe selle op verskeie punte in die volume van die substraat vasgemaak word.

Volgende word Petri-skottels vir 2 dae by 22 °C in 'n termostaat geplaas. Gedurende hierdie tyd vermeerder die selle in so 'n mate dat die kolonie wat deur elk van die selle gevorm word met die blote oog sigbaar word. Elkeen van hulle is 'n suiwer kultuur van die tipe bakterieë uit wie se selle ditroos.

Daarna, uit Petri-skottels, word mikro-organismes in aparte proefbuise gevul met 'n voedingsmedium gesubkuleer. Op hierdie manier word suiwer kulture uit 'n gemengde monster geïsoleer. Hierdie metode dra die naam van sy ontwikkelaar - R. Koch. Dit word ook algemeen die bekermetode genoem, of uitputtende saai. Nadat suiwer kulture van verskeie tipes bakterieë verkry is, word hul vorm, spore en families bepaal.

Alle werk moet volgens die beginsels van asepsis uitgevoer word. Om voortydige ontwikkeling van mikroörganismes te vermy, moet die studie onmiddellik na monsterneming uitgevoer word. Kraanwater word ontleed nadat die eerste porsies gedreineer is, aangesien dit mikrobes kan bevat wat in pype en krane opgehoop is. Die mikroflora van vrugte, bessies en groente is hoofsaaklik op die oppervlak (skil) geleë, daarom word daaruit gewas. Om dit te doen, plaas die fetus in 'n steriele houer en vul dit met die benodigde hoeveelheid water. Dan word hulle redelik kragtig geskud en die water word in 'n ander houer gegooi. Gewasse van lapprodukte word ook in deppers verkry, maar vooraf word stukke van 'n gegewe grootte daaruit gesny.