Molekulêre biologiese navorsingsmetodes speel 'n groot rol in moderne medisyne, forensika en biologie. Danksy vooruitgang in die studie van DNA en RNA is 'n persoon in staat om die genoom van 'n organisme te bestudeer, die veroorsakende middel van 'n siekte te bepaal, die verlangde nukleïensuur in 'n mengsel van sure te herken, ens.
Molekulêre biologiese navorsingsmetodes. Wat is dit?
Terug in die 70's en 80's het wetenskaplikes vir die eerste keer daarin geslaag om die menslike genoom te ontsyfer. Hierdie gebeurtenis het stukrag gegee aan die ontwikkeling van genetiese ingenieurswese en molekulêre biologie. Die studie van die eienskappe van DNA en RNA het daartoe gelei dat dit nou moontlik is om hierdie nukleïensure te gebruik om 'n siekte te diagnoseer, bestudeer gene.
Verkry DNA en RNA
Molekulêre biologiese diagnostiese metodes vereis die teenwoordigheid van beginmateriaal: meer dikwels is dit nukleïensure. Daar is verskeie maniere om hierdie stowwe uit die selle van lewende organismes te isoleer. Elkeen van hulle het sy eie voordele en nadele, en dit is nodigin ag neem wanneer 'n metode gekies word om suiwer nukleïensure te isoleer.
1. Die verkryging van DNA volgens Marmur. Die metode bestaan uit die behandeling van 'n mengsel van stowwe met alkohol, waardeur suiwer DNS presipiteer. Die nadeel van hierdie metode is die gebruik van aggressiewe stowwe: fenol en chloroform.
2. Isolasie van DNA volgens Boom. Die hoofstof wat hier gebruik word, is guanidientiosianaat (GuSCN). Dit dra by tot die presipitasie van deoksiribonukleïensuur op gespesialiseerde substrate, waaruit dit vervolgens met 'n spesiale buffer versamel kan word. GuSCN is egter 'n inhibeerder van PTC, en selfs 'n klein deel daarvan wat in die gepresipiteerde DNA kom, kan die verloop van die polimerase kettingreaksie beïnvloed, wat 'n belangrike rol speel in die werk met nukleïensure.
3. Sedimentasie van onsuiwerhede. Die metode verskil van die voriges deurdat dit nie die molekules van deoksiribonukleïensuur is wat neerslaan nie, maar onsuiwerhede. Om dit te doen, word ioonuitruilers gebruik. Die nadeel is dat nie alle stowwe kan presipiteer nie.
4. Massa sifting. Hierdie metode word gebruik in gevalle waar presiese inligting oor die samestelling van die DNA-molekule nie nodig is nie, maar dit wel nodig is om statistiese data te verkry. Dit word verklaar deur die feit dat die struktuur van die nukleïensuur beskadig kan word wanneer dit met skoonmaakmiddels, veral alkalies, behandel word.
Klassifikasie van navorsingsmetodes
Alle molekulêre biologiese navorsingsmetodes word in drie groot groepe verdeel:
1. Amplifikasie (met behulp van baie ensieme). Hierverwys na PCR - polimerase kettingreaksie, wat 'n groot rol speel in baie van die diagnostiese metodes.
2. Nie-versterkend. Hierdie groep metodes hou direk verband met die werking van mengsels van nukleïensure. Voorbeelde is 3 vlekke, in situ hibridisasie, ens.
3. Metodes gebaseer op die herkenning van 'n sein van 'n sondemolekule wat aan 'n spesifieke sonde-DNS of RNA bind. 'n Voorbeeld is die Hibride Capture System (hc2).
Ensieme wat in molekulêre biologie navorsingsmetodes gebruik kan word
Baie molekulêre diagnostiese metodes behels die gebruik van 'n wye reeks ensieme. Hieronder is die mees gebruikte:
1. Beperkingsensiem - "sny" die DNA-molekule in die nodige dele.
2. DNA-polimerase - sintetiseer 'n dubbelstring molekule van deoksiribonukleïensuur.
3. Omgekeerde transkriptase (revertase) - word gebruik om DNA op 'n RNA-sjabloon te sintetiseer.
4. DNA-ligase - verantwoordelik vir die vorming van fosfodiesterbindings tussen nukleotiede.
5. Eksonuklease - verwyder nukleotiede van die terminale dele van die deoksiribonukleïensuurmolekule.
PCR is die hoofmetode van DNA-amplifikasie
Polymerase-kettingreaksie (PCR) word aktief in moderne molekulêre biologie gebruik. Dit is 'n metode waarin 'n groot aantal kopieë van 'n enkele DNA-molekule verkry kan word (molekules word geamplifiseer).
Hooffunksies van PCR:
- diagnostieksiektes;
- kloning van DNA-segmente, gene.
Die volgende elemente word benodig om 'n polimerase-kettingreaksie uit te voer: die aanvanklike DNS-molekule, 'n termostabiele DNS-polimerase (Taq of Pfu), deoksiribonukleotiedfosfate (bronne van stikstofbasisse), primers (2 primers per 1 DNS-molekule).) en die bufferstelsel self, waarin alle reaksies moontlik is.
PCR bestaan uit drie stappe: denaturering, primer-gloeiing en verlenging.
1. Denaturasie. By 'n temperatuur van 94-95 grade Celsius word die waterstofbindings tussen die twee stringe DNA gebreek, en gevolglik kry ons twee enkelstrengige molekules.
2. Primer uitgloeiing. By 'n temperatuur van 50-60 grade Celsius word primers aan die punte van enkelstrengige nukleïensuurmolekules geheg deur die tipe komplementariteit.
3. Verlenging. By 'n temperatuur van 72 grade vind die sintese van dogter dubbelstring molekules van deoksiribonukleïensuur plaas.
DNA-volgordebepaling
Molekulêre biologiese navorsingsmetodes vereis dikwels kennis van die nukleotiedvolgorde in 'n deoksiribonukleïensuurmolekule. Volgordebepaling word uitgevoer om die genetiese kode te bepaal. Molekulêre diagnostiek van die toekoms sal gebaseer wees op kennis verkry uit menslike volgordebepaling.
Die volgende tipes volgordebepaling word onderskei:
- Maxam-Gilbert-volgorde;
- Sanger-volgorde;
- pyrosequencing;
- nanoporeopeenvolging.
