Absorpsie en verdere heruitstraling van lig deur anorganiese en organiese media is die gevolg van fosforessensie of fluoressensie. Die verskil tussen die verskynsels is die lengte van die interval tussen ligabsorpsie en emissie van die stroom. Met fluoressensie vind hierdie prosesse feitlik gelyktydig plaas, en met fosforessensie, met 'n bietjie vertraging.
Historiese agtergrond
In 1852 het die Britse wetenskaplike Stokes die eerste keer fluoressensie beskryf. Hy het die nuwe term geskep as gevolg van sy eksperimente met vloeispaat, wat rooi lig uitstraal wanneer dit aan ultravioletlig blootgestel word. Stokes het 'n interessante verskynsel opgemerk. Hy het gevind dat die golflengte van fluoresserende lig altyd langer is as dié van die opwekkingslig.
Baie eksperimente is in die 19de eeu uitgevoer om die hipotese te bevestig. Hulle het getoon dat 'n verskeidenheid monsters fluoresseer wanneer dit aan ultraviolet lig blootgestel word. Materiale het onder andere kristalle, harse, minerale, chlorofil,medisinale grondstowwe, anorganiese verbindings, vitamiene, olies. Die direkte gebruik van kleurstowwe vir biologiese ontleding het eers in 1930 begin
Fluoressensiemikroskopiebeskrywing
Sommige van die materiale wat in die eerste helfte van die 20ste eeu in navorsing gebruik is, was hoogs spesifiek. Danksy aanwysers wat nie deur kontrasmetodes bereik kon word nie, het die fluoressensiemikroskopiemetode 'n belangrike hulpmiddel in beide biomediese en biologiese navorsing geword. Die resultate wat verkry is, was van geen geringe belang vir materiaalwetenskap.
Wat is die voordele van fluoressensiemikroskopie? Met die hulp van nuwe materiale het dit moontlik geword om hoogs spesifieke selle en submikroskopiese komponente te isoleer. Met 'n fluoresserende mikroskoop kan jy individuele molekules opspoor. Met 'n verskeidenheid kleurstowwe kan u verskeie elemente op dieselfde tyd identifiseer. Alhoewel die ruimtelike resolusie van die toerusting beperk word deur die diffraksiegrens, wat op sy beurt afhang van die spesifieke eienskappe van die monster, is die opsporing van molekules onder hierdie vlak ook heel moontlik. Verskeie monsters vertoon outofluoressensie na bestraling. Hierdie verskynsel word wyd gebruik in petrologie, plantkunde, halfgeleier industrie.
Kenmerke
Die studie van diereweefsels of patogene mikroörganismes word dikwels bemoeilik deur óf te swak óf baie sterk nie-spesifieke outofluoressensie. Die waarde innavorsing verkry die inleiding tot die materiaal van komponente wat op 'n spesifieke golflengte opgewek word en 'n ligvloed van die vereiste intensiteit uitstraal. Fluorochrome dien as kleurstowwe wat in staat is om self aan strukture te heg (onsigbaar of sigbaar). Terselfdertyd word hulle deur hoë selektiwiteit met betrekking tot teikens en kwantumopbrengs onderskei.
Fluoressensiemikroskopie het wyd gebruik geword met die koms van natuurlike en sintetiese kleurstowwe. Hulle het spesifieke emissie- en opwekkingsintensiteitprofiele gehad en was op spesifieke biologiese teikens gemik.
Identifisering van individuele molekules
Dikwels, onder ideale toestande, kan jy die gloed van 'n enkele element registreer. Om dit onder meer te doen, is dit nodig om voldoende lae detektorgeraas en optiese agtergrond te verseker.’n Fluoresceïenmolekule kan tot 300 000 fotone uitstraal voor vernietiging as gevolg van fotobleiking. Met 'n invorderingskoers van 20% en prosesdoeltreffendheid, kan hulle geregistreer word in die bedrag van ongeveer 60 duisend
Fluoressensiemikroskopie, gebaseer op stortvloedfotodiodes of elektronvermenigvuldiging, het navorsers toegelaat om die gedrag van individuele molekules vir sekondes, en in sommige gevalle minute, waar te neem.
Moeilikhede
Die sleutelprobleem is geraasonderdrukking vanaf die optiese agtergrond. As gevolg van die feit dat baie van die materiale wat gebruik word in die konstruksie van filters en lense 'n mate van outofluoressensie vertoon, was die pogings van wetenskaplikes in die aanvanklike stadiums gefokus op die uitreikingkomponente met lae fluoressensie. Daaropvolgende eksperimente het egter tot nuwe gevolgtrekkings gelei. Daar is veral gevind dat fluoressensiemikroskopie gebaseer op totale interne refleksie lae agtergrond en hoë opwekkingsliguitset bereik.
Mechanism
Die beginsels van fluoressensiemikroskopie gebaseer op totale interne refleksie is om 'n vinnig verrottende of nie-voortplantende golf te gebruik. Dit ontstaan by die raakvlak tussen media met verskillende brekingsindekse. In hierdie geval gaan die ligstraal deur 'n prisma. Dit het 'n hoë brekingsindeks.
Die prisma is langs 'n waterige oplossing of glas met 'n lae parameter. As die ligstraal daarop gerig word teen 'n hoek wat groter is as die kritieke een, word die straal heeltemal vanaf die koppelvlak gereflekteer. Hierdie verskynsel gee op sy beurt aanleiding tot 'n nie-voortplantende golf. Met ander woorde, 'n elektromagnetiese veld word opgewek wat 'n medium met 'n laer brekingsindeks binnedring op 'n afstand van minder as 200 nanometer.
In 'n nie-voortplantende golf sal die ligintensiteit redelik voldoende wees om fluorofore op te wek. As gevolg van sy buitengewoon vlak diepte, sal sy volume egter baie klein wees. Die resultaat is 'n lae-vlak agtergrond.
Wysiging
Fluoressensiemikroskopie gebaseer op totale interne refleksie kan met epi-beligting gerealiseer word. Dit vereis lense met verhoogde numeriese diafragma (ten minste 1,4, maar dit is wenslik dat dit 1,45-1,6 bereik), sowel as 'n gedeeltelik verligte veld van die apparaat. Laasgenoemde word bereik met 'n klein kol. Vir groter eenvormigheid word 'n dun ring gebruik waardeur 'n deel van die vloei geblokkeer word. Om 'n kritieke hoek te verkry waarna totale refleksie plaasvind, is 'n hoë vlak van breking van die onderdompelingsmedium in die lense en die mikroskoopdekglas nodig.